28°C에서 25일간 정치 배양한 결과, 느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC620 유래 라카아제가 진균 배양 배지에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 이 효소의 최적 pH와 온도는 각각 3.0과 70°C였다. 40°C와 50°C에서 2시간 배양 후, 효소 활성은 각각 68.33%와 59.61%를 유지했다. 시트르산-인산 완충액(pH 7.0)에서 2시간 배양 후에도 효소 활성은 100%를 유지했다. 10 mM MgSO₄와 CuSO₄를 첨가했을 때 효소 활성은 각각 약 21%와 35% 증가한 반면, NaCl, MnCl₂, KCl, CaCl₂는 효소 활성을 억제했다. ABTS를 기질로 사용하여 느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC 620 라카아제의 반응 속도 상수(Km 및 Vmax)는 각각 1.99 mM 및 16,217 μmol min⁻¹ L⁻¹로 나타났습니다. 사과 주스 시료에 대한 효소 처리는 pH와 점도를 유의하게 감소시켰으며, 이러한 감소는 저장 기간 증가와 상관관계가 있었습니다. 라카아제 처리는 사과 주스의 총 페놀 함량을 약간 감소시켰지만, 항산화 활성의 감소는 관찰되지 않았습니다.
최근 몇 년 동안 연구자들은 식품 산업에 친환경 생명공학 기술을 적용하는 데 집중해 왔습니다. 라카아제는 식품 산업에서 가장 유용한 효소 중 하나로, 주스 가공, 제빵, 와인 안정화, 식품의 관능적 품질 향상 등 다양한 분야에 응용됩니다.1많은 고등 식물과 미생물은 라카아제를 분비합니다.2그리고 불완전균류, 자낭균류, 담자균류와 같은 균류도 라카아제를 생성할 수 있습니다.3라카제(EC 1.10.3.2)는 세 개의 서로 다른 구리 원자로 구성된 시스템을 이용하여 분자 산소를 물로 환원시키는 청색 산화효소로, 다양한 페놀 화합물과 방향족 아민을 산화시킵니다. 과일 및 채소 주스 생산 과정에서 효소적 및 비효소적 갈변 현상은 중요한 문제입니다.4이러한 물질들은 주스의 색, 맛, 향에 부정적인 영향을 미치므로 제거해야 합니다.5
모든 과일 중에서 사과는 전 세계적으로, 그리고 유럽 연합에서 가장 많이 소비되는 과일입니다. 2019년 사과 생산량은 8,700만 톤을 넘어 세계 3위를 기록했습니다.6사과에는 플라보노이드와 카페인산, 클로로겐산과 같은 페놀산을 비롯한 수많은 페놀 화합물이 함유되어 있습니다.7사과 주스는 일반적으로 투명한 형태로 섭취되기 때문에 여과 과정에서 페놀 성분의 약 50%에서 90%가 손실됩니다.8오늘날 소비자들은 폴리페놀 함량이 높은 탁한 사과 주스와 같이 가공을 최소화한 제품을 선호하는 경향이 있습니다. 그러나 폴리페놀 함량이 높기 때문에 이러한 종류의 사과 주스는 변색 및 검게 변하기 쉽습니다.9사과 주스의 변색을 줄이거나 방지하기 위해 60~90°C에서의 저온살균과 같은 열처리 방법을 포함한 다양한 기술이 사용됩니다.10그러나 Sauceda-Gálvez의 연구에 따르면11열처리 과정은 휘발성 화학물질을 파괴하고 사과 주스의 관능적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 열처리 방법의 대안으로는 초임계 이산화탄소, 자외선, 초음파, 고압 처리 또는 고압 균질화 등이 있습니다.12이러한 기술의 효율성과 적합한 과일 주스의 수율은 사용되는 매개변수와 제품 특성에 따라 달라집니다. 하지만 높은 비용, 일부 식품의 품질에 미치는 악영향, 또는 불충분한 효소 불활성화로 인해 이러한 기술의 광범위한 사용이 제한됩니다.13,14
라카아제는 과일 주스를 안정화하고 투명하게 만드는 데 사용할 수 있습니다.15괴크멘 등16라카아제는 페놀 화합물을 중합체 또는 올리고머로 전환시켜 모든 초여과막으로 쉽게 제거할 수 있기 때문에 과일 주스 정제에 사용을 권장합니다. 이를 통해 사과 주스는 50°C에서 최대 6주 동안 안정적인 색상과 투명도를 유지할 수 있습니다. 정제된 트리코더마(Trichoderma) 라카아제를 알루미나 비드에 고정화하여 사과 주스의 미생물 오염으로 인한 이취 유발 화합물을 선택적으로 제거하는 데 사용했습니다.17
사과 주스의 휘발성 성분 중 약 80~90%는 에스테르와 알데히드이며, 이는 주스에 독특한 향을 부여합니다.18사과 주스 정제를 위해 어린 코코넛 껍질에서 추출한 천연 섬유로 만든 저렴한 지지체에 *Trametes versicolor* 유래 라카아제 효소를 고정화했습니다.19이전 연구에서는 효소를 사용하지 않거나 효소 고정화 방법을 사용하거나, 또는 한외여과와 병행하여 사과 주스의 색상 및 탁도를 안정화하는 방법을 조사했습니다.5,19그러나 저장 중 곰팡이 라카아제가 사과 주스의 물리화학적 특성에 미치는 영향은 아직 불분명합니다. 따라서 본 연구는 곰팡이 라카아제 처리 후 2주간 냉장 보관한 사과 주스의 물리화학적 특성, 페놀 화합물 함량 및 항산화 활성 변화를 실험적으로 조사하는 것을 목표로 했습니다. 라카아제는 페놀 화합물을 산화시키는 능력이 있어 주스 정제를 포함한 다양한 산업 공정에 활용될 가능성이 높습니다. 본 연구에서는 느타리버섯(Pleurotus ostreatus NRC 620) 유래 라카아제를 대상으로 주스 정제에 있어 최적의 활성 조건과 효과를 규명하고자 했습니다. 느타리버섯(P. ostreatus NRC 620)에 대한 연구는 아직 제한적이지만, Trametes versicolor 및 Ganoderma lucidum 등 다양한 곰팡이 유래 효소에 대한 연구는 이미 진행된 바 있습니다. 본 연구는 식품 산업에서 이 효소의 잠재적 응용 가능성을 평가하고, 특히 최적의 pH와 온도와 같은 고유한 특성을 밝히는 것을 목표로 합니다.
2,2′-아조옥시비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS)은 Sigma-Aldrich(캐나다)에서 구입했습니다. 그 외 모든 시약은 분석 등급을 사용했습니다.
국립연구센터 미생물배양수집센터에서 알려진 느타리버섯 균주 NRC620을 확보하였다. 계대배양 후, 이 균주는 감자덱스트로스한천배지 사면배지에 4°C에서 보관하였다. 접종원 준비 방법은 다음과 같다. 10일 된, 완전히 발달한 균사를 감자덱스트로스한천배지에 접종하고 28°C에서 배양하였다. 10일 후, 멸균된 금속 펀치를 이용하여 직경 12mm의 균사체 덩어리 세 개를 한천배지에서 떼어내어, 멸균된 배양액(pH 5.0, Othman et al.이 이전에 설명한 바와 같음) 50mL가 담긴 솜마개가 있는 250mL 삼각플라스크에 넣었다.20배양액은 28°C에서 18일 동안 배양하였다. 그런 다음 배양액을 Whatman No. 1 필터 페이퍼로 여과하고, 얻어진 상등액을 효소원으로 사용하였다.
라카아제 활성은 ABTS를 기질로 사용하여 측정하였다. 반응 혼합물(2 mL)은 0.3 mM ABTS(0.1 M 시트르산나트륨 완충액, pH 4.5에 용해) 500 μL와 증류수로 희석한 필요한 양의 효소 시료를 포함하였다.21,22라카아제가 실온(28°C ± 2)에서 ABTS를 산화시킬 수 있다는 점을 고려하여, ABTS 산화는 420nm에서의 흡광도 증가(ε)를 측정하여 결정하였다.420= 36,000cm-1 M -1라카아제 활성도는 애질런트 캐리-100 UV 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 라카아제 활성 1단위는 1분당 1μmol의 ABTS를 산화시키는 데 필요한 활성으로 정의하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 내부 대조군으로 사용하여 브래드포드법으로 측정하였다.23,24
느타리버섯 균주 NRC 620에서 효소를 얻은 후, 28°C의 정지 조건에서 25일 동안 다양한 배양 간격으로 효소 활성을 측정하였다.
라카아제 활성에 미치는 온도의 영향을 연구하기 위해 20~90°C 범위에서 실험을 수행했습니다. 효소를 첨가하고 반응을 시작하기 전에 완충액(0.1M 시트르산나트륨, pH 4.5)과 기질(ABTS)을 혼합하고 다양한 온도에서 5분 동안 배양했습니다. 효소의 열 안정성은 0.05M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 40, 50, 60, 70°C에서 각각 2시간 동안 배양하여 평가했습니다. 이후 ABTS 기질을 사용하여 잔류 활성을 측정했습니다.
pH가 라카아제 활성에 미치는 영향을 ABTS를 기질로 사용하여 pH 범위 2.5~7.0의 0.1 M 시트르산-인산 완충액에서 평가했습니다. 효소 용액을 0.1 M 시트르산 및 트리스 완충액(pH 3, 4, 6, 7)에서 40°C로 2시간 동안 배양하여 pH 안정성을 평가했습니다. 배양 후 ABTS를 기질로 사용했을 때의 잔류 활성을 계산했습니다.
라카아제를 다양한 금속 이온(Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, 및 Mn2+)을 각각 2.5 mM 및 10 mM 농도로 포함하는 0.05 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 10분 동안 배양하였다. 그 후 기질(ABTS)을 첨가하여 반응을 시작하고 상대적 활성을 측정하였다.
pH 4.5에서 다양한 농도(0.025–3 mM)의 라카아제에 의한 ABTS 산화 반응을 측정하여 속도론적 매개변수(Vmax 및 Km)를 결정했습니다.상수미카엘리스-멘텐 방정식의 값은 반응 속도의 역수를 기질 농도의 함수로 나타낸 라인위버-버크 플롯을 이용하여 계산하였다. 속도 상수는 GraphPad Prism 버전 6.01 소프트웨어를 사용하여 라인위버-버크 플롯으로부터 계산하였다.
사과를 수돗물로 깨끗이 씻은 후 반으로 잘라 독일산 브라운 MP80 전자동 사과 착즙기를 사용하여 즙을 냈습니다. 착즙액은 네 겹의 거즈로 걸러냈습니다. 대조군에는 효소를 첨가하지 않았고, 대조군에는 갓 짜낸 사과즙에 2.0% 라카아제(실험에서 가장 효과적인 농도)를 첨가한 후 4°C에서 2주간 보관했습니다.
적정산도(TA)와 pH는 Boulton 등의 방법에 따라 측정하였다.알.27각 시료의 pH는 디지털 pH 측정기(JENWAY 3510 pH 측정기)를 사용하여 측정하였다. 적정산도(TA)는 말산을 기준으로 다음 공식을 이용하여 계산하였다.
여기서 V와 C는 각각 적정에 사용된 수산화나트륨 용액의 부피(mL)와 농도(0.1 mol/L)입니다. K는 말산 전환 계수로 0.067이며, W는 사과 주스의 질량(g)입니다.
총 용해성 고형물(TDS모든 주스 샘플의 굴절률(O₂)은 PAL-1 포켓 굴절계(ATAGO, 도쿄, 일본)를 사용하여 측정했습니다. 측정 후 광학 렌즈를 탈이온수로 세척했으며, 각 사과 주스 샘플은 세 번씩 측정했습니다. 각 샘플의 O₂ 값은 세 번의 측정값을 평균하여 계산했습니다. 각 사과 주스 샘플의 평균값 ± 표준편차 또한 이러한 결과들을 평균하여 계산했습니다.
사과 주스 시료의 점탄성은 회전식 점도계(RV, Rheotest 2, 독일)를 사용하여 측정하였다. 시료는 점도계의 "S2" 실린더 내부에 넣었다. 겉보기 점도는 전단 응력 대 전단 속도 곡선의 기울기로 나타냈으며, 이는 다양한 전단 속도(1.00~437.4 s⁻¹)에서의 전단 응력과 해당 곡선으로부터 계산하였다. 겉보기 점도 계산 공식은 다음과 같다.
여기서 η는 겉보기 점도(cP), τ는 전단 응력(dyn/cm²), γ는 전단 속도(sec⁻¹)이며, (τ)는 다음 공식을 사용하여 토크(α)와 실린더(Z) 값을 이용하여 계산됩니다: τ = Z . α.
갈변지수는 Meidav et의 방법에 따라 측정하였다.알.2910ml의 주스 샘플을 2750 xg에서 10분간 원심분리했습니다. 주스 상등액 5ml에 95% 에탄올 5ml를 혼합했습니다. 시마즈 UV 분광광도계(UV-1601 PC)를 사용하여 혼합물의 흡광도를 420nm에서 측정했습니다.
총 페놀 함량(TPC)은 Boulton et al.이 설명한 바와 같이 Folin-Ciocalteu 시약을 사용하여 비색법으로 측정하였다.[27]. 갈산의 표준 곡선은 0~500 mg/L 농도 범위에 대해 작성되었습니다.r²= 0.997). 결과는 갈산 등가량(mg GAE/mL)으로 표시됩니다.
사과 주스 25 μL에 증류수 125 μL와 FRAP 용액 2850 μL를 넣고 혼합물을 어두운 곳에 보관합니다.30분. 그런 다음 Shimadzu UV 분광광도계(UV-1601 PC)를 사용하여 593 nm에서 흡광도를 측정합니다. FRAP 시약은 300 mM 아세트산 완충액(pH 3.6), 20 mM 염화철(III) 및 10 mM 2,4,6-트리스(2-피리딜)트리아진(TPTZ)(40 mM HCl에 용해)을 10:1:1의 비율로 혼합하여 제조했습니다. Trolox를 표준 물질로 사용하여 표준 곡선을 작성했습니다.R²= 0.999)이며, 결과는 μM Trolox/mL로 표시됩니다.
처리된 주스와 처리되지 않은 주스의 항산화 활성은 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 능력을 평가하기 위해 DPPH 방법을 사용하여 측정했습니다.31주스 10마이크로리터를 메탄올에 용해된 DPPH 용액(100μM) 1ml와 혼합하였다. 30분 동안 암실에서 반응시킨 후, 시마즈 UV 분광광도계(UV-1601 PC)를 사용하여 517nm에서 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 결과는 검정 곡선을 기준으로 트롤록스 등가량(μM 트롤록스/ml)으로 나타냈다.R2= 0.990).
얻어진 데이터에 따르면, NRC 620 느타리버섯에서 라카아제 생산량은 발효 18일째에 최대치인 1302 U/L의 활성을 나타냈다. 이는 라카아제 생산을 위한 최적 배양 시간을 결정하는 근거가 되었다(그림 1). 효소 생산량은 배양 시간이 증가함에 따라 증가했지만, 증가율은 배양 시간에 정비례하지 않았다. 21일 후에는 효소 활성이 90 U/L(1390 U/L)만 증가했다. 따라서 생산량과 배양 시간 연장에 따른 경제적 이점의 균형을 고려하여 18일을 최적 배양 시간으로 최종 선정하였다.
느타리버섯 NRC 620 균주에서 배양 시간이 라카아제 수율에 미치는 영향. 12mm 크기의 균사체 블록 3개를 멸균 배지 50ml에 접종한 후 28°C에서 다양한 시간 동안 배양하였다.
다른 연구들과 마찬가지로, 우리의 결과는 곰팡이의 라카아제 분비가 최고조에 달하는 이상적인 배양 기간이 7일에서 36일 사이일 가능성이 높다는 것을 시사합니다.32Ezike 등의 연구에 따르면,33Trametes polyzona WRF03은 발효 9일째에 가장 많은 양의 라카아제를 생산했으며, 그 특이 활성은 1637 U/mg 단백질이었습니다. 또한 Othman et al.34*Trichoderma harzianum* S7113 균주는 배양 5일째에 다량의 라카아제를 분비하는 것으로 나타났다. 라카아제 생산 속도는 14일째에 최고 활성을 보인 후 점차 감소했다.34효소 분비는 주된 성장 단계에서도 발생할 수 있지만, 일반적으로 중간 단계에서 최고조에 달하며 탄소 또는 질소 공급원의 소비에 의해 촉발됩니다.34,35
느타리버섯 NRC 620 유래 라카아제는 50°C에서 80°C에 이르는 넓은 온도 범위에서 높은 활성을 보였으며, 최고 활성(69~98%)에 근접했지만, 70°C에서 최대 활성을 나타냈다(그림 2a). 이 온도 범위를 벗어나면 효소 활성은 약 70°C 부근에서 감소했다. 이러한 결과는 효소가 고온에서 활성을 나타내는 이유가 고온에서 반응의 운동 에너지가 증가하기 때문임을 시사한다.
느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC 620 균주에서 반응 온도(a)와 pH(b)가 라카아제 활성에 미치는 영향. 20~90°C 범위의 온도는 효소를 첨가하고 반응을 시작하기 전에 혼합물을 각기 다른 온도에서 5분간 전처리하여 얻었다. pH가 라카아제 활성에 미치는 영향은 0.1M 시트르산-인산 완충액을 포함하는 용액에서 ABTS를 기질로 사용하여 pH 2.5~7.0 범위에서 평가하였다.
에지케에 따르면알.33트라메테스 폴리조나(Trametes polyzona) WRF03 라카아제의 최적 온도는 55°C이며, 이는 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 최적 온도와 동일합니다.라카제36*Trametes polyzona* KU-RNW02737의 최적 온도(50°C)와 유사합니다.라카제 . 발드리안38다른 리그닌 분해 효소 시스템과 마찬가지로 라카아제의 이상적인 온도 범위는 50~70°C 사이라고 언급되어 있습니다.
실험 결과, 해당 효소는 pH 3.0에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH 3.5에서는 94%의 활성을 나타냈다. 그러나 pH 2.5에서 7.0에 이르는 넓은 pH 범위에서 활성을 유지했다(그림 2b). 또한, 중성 또는 알칼리성 조건보다 산성 조건에서 더 높은 활성을 보였다. pH 2.5에서 4.5 범위에서는 최소 77%의 활성을 유지했지만, pH 7.0에서는 약 38%에 그쳤다. Trametes polyzona WRF03 유래 라카아제의 최적 pH는 4.533으로, Trametes polyzona KU-RNW02737, Trichoderma harzanium 39, Pleurotus sp. 40, Trametes hirsuta 41 유래 라카아제의 최적 pH와 동일하다. 그러나 Chairin 등의 연구에 따르면,42*Polymorpha f. sp.* WR710-1 유래 라카아제의 최적 pH는 2.2인 반면, *Polymorpha f. sp.* IBL-04 유래 라카아제의 최적 pH는 5.043입니다. 중성 또는 알칼리성 pH 조건에서 라카아제 활성이 감소하는 이유는 T2/T3 라카아제의 구리 원자에 수산화 음이온(라카아제 억제제)이 결합하기 때문일 수 있습니다. 이는 T1 중심에서 T2/T3 중심으로의 내부 전자 전달을 방해하여 라카아제 활성을 저하시킬 수 있습니다.제한하다효소 활성23,44
다양한 온도에서 효소를 배양한 결과, 배양 시간과 온도 모두 효소 안정성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 특히, Trametes polyzona NRC 620 유래 라카아제는 40℃와 50℃에서 높은 안정성을 보였으며, 120분 후 초기 활성의 각각 68.33%와 59.61%를 유지했습니다(그림 3a). 반면, 동일 조건(40℃ 및 50℃, 120분)에서 Trametes polyzona WRF03 유래 라카아제는 각각 64.38%와 42.92%의 활성을 유지했습니다.33반대로, 배양 시간과 온도가 증가함에 따라 *Trametes polyzona* NRC 620 라카아제의 안정성은 감소했습니다. 60℃와 70℃에서 60분 동안 배양했을 때, 그 활성은 각각 39.24%와 1.72%로 감소했습니다(그림 3a). 실험 결과와 일치하게, *Trametes polyzona* WRF03 유래 라카아제는 열처리 과정 전반에 걸쳐 40℃와 50℃에서 더 높은 안정성을 보였습니다.33마찬가지로 Lueangjaroenkit et알.37그리고 Chairin et알.42Trametes polyzona KURNW027과 Trametes polyzona WR710-1에서 유래한 라카아제의 50°C에서의 안정성이 각각 보고되었습니다. 다양한 생명공학 분야에 적용 가능한 유용한 생촉매로서, 라카아제는 넓은 온도 범위에서 우수한 안정성과 성능을 보여야 합니다.
느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC 620 유래 라카아제의 내열 안정성(a) 및 pH 안정성(b). 내열 안정성은 효소 용액을 0.05 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 넣고 40, 50, 60, 70 °C에서 각각 2시간 동안 배양하여 평가하였다. pH 안정성은 효소 용액을 0.1 M 시트르산 완충액 및 트리스 완충액(pH 3, 4, 6, 7)에 넣고 40 °C에서 2시간 동안 배양하여 평가하였다. 배양 후 잔류 활성은 ABTS를 기질로 사용하여 계산하였다.
효소 사용 및 보관에 대한 최적 조건을 결정하기 위해 pH가 라카아제 안정성에 미치는 영향을 조사했습니다. 다양한 pH 값에 노출되면 단백질 구조의 안정성에 상당한 영향을 미쳐 효소 분자의 안정성과 활성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 연구 결과, 효소는 산성 조건에서 안정성이 떨어지고 pH가 높을수록(중성 및 알칼리성 영역) 안정성이 향상되는 것으로 나타났습니다. pH 7.0, 6.0, 4.0, 3.0에서 120분 후 효소 잔존율은 각각 약 100%, 62.54%, 52.39%, 11.14%였습니다(그림 3b). *Strombus multisus* WRF03 라카아제는 중성 pH(5.5~6.5)에서 높은 안정성을 보였고, 산성 pH(4.0 미만)에서는 낮은 안정성을 보였습니다. pH 5.5, 6.0, 6.5에서 120분 후 효소 잔류율은 각각 약 82%, 100%, 93%였다.33카이린 등42Trametes polyzona WR710-1의 라카아제가 pH 6.0~7.0 범위에서 안정적이라는 점을 언급했으며, Sayed et al.은 다음과 같이 언급했습니다.45연구 결과에 따르면 라카아제는 중성 pH 조건에서 더 안정적인 것으로 나타났습니다. 그러나 Cerrena unicolor에서 추출한 라카아제는 알칼리 조건(pH 9.0)에서도 안정성을 보였습니다.46연구된 라카아제는 넓은 pH 범위에 걸쳐 높은 안정성을 보였습니다. 이는 산업 응용 분야에 중요한 특성일 수 있습니다.
일부 금속 이온은 효소 활성에 촉진 효과와 억제 효과를 모두 나타내므로 산업 응용 분야에서는 효소 활성에 미치는 영향을 반드시 고려해야 합니다. 이는 금속 이온이 세포외 효소의 안정성과 합성에 영향을 미칠 수 있는 흔한 환경 오염 물질이기 때문에 매우 중요합니다.47느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC 620 유래 라카아제에 대한 다양한 금속 이온의 영향을 조사하기 위해 관련 실험을 수행했습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이, 사용된 금속의 종류에 따라 금속 이온 농도를 2.5 mM에서 10 mM로 증가시키면 효소 기능에 부정적인 영향을 미쳤습니다. 예를 들어,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, 그리고Cu²⁺효소 활동을 자극하고 활성화할 수 있는 반면,Na⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, 그리고K⁺이온들은 효소 활성을 억제할 수 있다. 10 mM 농도에서 Cu²⁺ 및 Mg²⁺ 이온은 느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC 620 유래 라카아제 활성을 가장 강력하게 활성화시키는 물질로, 각각 약 34%와 20%의 활성화율을 나타냈다. 그러나 10 mM 농도에서 Ca²⁺ 이온은 라카아제 활성을 가장 강력하게 억제하는 물질로, 효소 활성을 약 60% 감소시켰다.
느타리버섯 NRC 620 라카아제 활성에 대한 금속 이온의 영향. 라카아제를 2.5 mM 및 10 mM 농도의 다양한 금속 이온을 포함하는 0.05 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 10분 동안 배양하였다. 그 후 기질(ABTS)을 첨가하여 반응을 시작하고 상대적 활성을 측정하였다.
본 연구 결과는 Mg²⁺와 Cu²⁺가 Trametes polyzona WRF03³의 활성을 증진시킨다는 다른 연구자들의 결과와 일치합니다. Castaño 등⁴⁸은 Xylaria sp. 유래 라카아제가 구리 이온(Cu²⁺)에 의해 어느 정도 활성이 촉진된다는 것을 발견했습니다. 또한 Foroutanfar 등⁴⁹과 Si 등⁵⁰은 각각 Paraconiothyrium variabile과 Trametes pubescens 유래 라카아제에 대해 유사한 연구를 수행했습니다. 이 효소의 II형 구리 결합 부위(T2)는 특정 농도에서 Cu²⁺로 포화될 수 있으며, 이는 높은 Cu²⁺³⁹ 농도에서 라카아제 활성이 촉진되는 이유를 설명할 수 있습니다. 백색 부패균 라카아제는 여러 개의 구리 원자를 포함하는 산화효소이므로, 구리 이온이 라카아제 활성에 미치는 영향은 자극, 억제, 중립 등 다양합니다.⁵¹ 이와 대조적으로 Zhou et al.. [52]보도된 바에 따르면Cu²⁺대만 흰개미(Odontotermes formosanus)의 라카아제 활성을 억제했습니다. 그러나 Cerena sp. HYB07의 라카아제는[53]그리고 클리토시베 막시마[54]구리 이온의 영향을 받지 않았습니다.
기질 특이성은 동역학적 매개변수(Km 및 Vmax)로 나타냈습니다. 기질과 효소의 결합 친화력이 강할수록 Km 값은 낮아지고 기질 특이성은 높아집니다.3,21,55느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC 620 유래 라카아제의 동역학적 매개변수(Km 및 Vmax)는 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Lineweaver-Burk 플롯을 그려 결정했습니다(그림 5). ABTS를 기질로 사용했을 때, 결과는 Km 1.99 mM 및 Vmax 16217 μmol이었습니다.분⁻¹ L⁻¹,각각. Elsayed et al.21ABTS 산화에 대한 Km 값은 각각 0.1 mM과 0.064 mM로 보고되었으며, 이는 Lac A 및 Lac B 동위효소가 ABTS에 대해 높은 친화성을 가지고 있음을 나타냅니다. 또한, Vmax 값은 0.182 μmol이었습니다.분⁻¹그리고 0.603 μmol분⁻¹각각 얻어진 Km 값은 Trametes polyzona WRF03(8.66 mM)보다 낮았으며, 또한 Vmax 값(1429 mmol min⁻¹)도 더 낮았습니다.낮추다ABTS를 기질로 사용했을 때와 마찬가지로, Lentinus squarrosulus MR13 및 Trametes sp. AH28-2 라카아제 농도의 Km 값은 각각 0.0714 mM 및 0.025 mM이었고, Vmax 값은 0.0091 mM min−1 및 0.67 mM min−1 mg−1 (ABTS 기준)이었다.각각 56,57
느타리버섯(Pleurotus ostreatus) NRC 620 유래 라카아제의 활성에 대한 ABTS 농도의 영향을 조사하고, 초기 반응 속도의 역수와 ABTS 농도 간의 관계를 나타내는 Lineweaver-Burk 도표를 작성하였다. pH 4.5에서 다양한 농도(0.025–3.0 mM)의 라카아제를 사용하여 ABTS의 산화 반응을 측정하고, 속도론적 매개변수(Vmax 및 Km)를 결정하였다. 반응 속도의 역수와 기질 농도 간의 관계를 나타내는 Lineweaver-Burk 도표를 이용하여 Michaelis-Menten 속도 상수를 계산하였다. 속도 상수 계산에는 GraphPad Prism 6.01 소프트웨어를 사용하였다.
펙티나아제와 같은 전통적인 정제 효소는 펙틴 물질을 가수분해하여 점도와 탁도를 낮춥니다. 이러한 효소는 구조적 다당류를 효과적으로 분해하며, 수율과 투명도를 향상시키기 위해 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제와 같은 다른 효소와 함께 사용되는 경우가 많습니다. 그러나 펙티나아제는 특히 사과 주스나 포도 주스와 같은 주스에서 탁도와 산화적 갈변의 주요 원인인 페놀 화합물을 특이적으로 분해하지는 않습니다.58반면, 라카아제는 페놀 화합물의 산화 반응을 촉매하여 이들을 더 크고 불용성인 분자로 중합시켜 침전이나 여과를 통해 제거할 수 있도록 합니다. 이러한 메커니즘은 주스의 투명도를 향상시킬 뿐만 아니라 페놀 화합물로 인한 산화 갈변 가능성을 줄여 유통기한을 연장합니다. 더욱이, 라카아제 기반 정제 공정은 온화한 처리 조건(pH 3.5~5.5, 온도 25~40°C)에서 수행할 수 있어 영양적 또는 관능적 특성을 손상시키지 않고 섬세한 주스에도 적합합니다.59연구에 따르면 펙티나아제 처리는 1~2시간 내에 주스를 맑게 할 수 있는 반면, 라카아제 처리는 페놀 화합물을 완전히 제거하는 데 일반적으로 더 긴 반응 시간(3~6시간)이 필요합니다. 그러나 효소를 고정화하거나 라카아제와 기계적 정제 방법을 병용하면 이 과정을 최적화할 수 있습니다.60본 연구에서 조추출물의 효소 분석 결과, 라카아제와 α-아밀라아제 활성이 유의미하게 나타났으나, 펙티나아제와 자일라나아제 활성은 극히 낮았고, 셀룰라아제 활성은 검출되지 않았다. 따라서 탁도 및 페놀 함량 감소는 주로 라카아제의 작용에 의한 것이며, 점도 변화는 부분적으로 아밀라아제의 작용에 의한 것으로 추정된다.
표 1은 갓 짜낸 사과 주스와 라카아제 처리 시료의 물리화학적 매개변수를 보여준다. 결과에 따르면 갓 짜낸 사과 주스의 수율(71.59%)은 라카아제 처리 시료의 수율(87.34%)보다 낮았다. 이러한 결과는 Pilnik과 Orange의 연구 결과와 일치한다.61효소를 과일 가공에 사용하면 주스 수율을 높이고 여과 효율을 개선하여 농축에 적합한 고품질의 투명한 주스를 얻을 수 있다고 합니다. 주스 수율 증가는 주로 주스 내 가용성 당 함량 증가에 기인합니다. 과일의 효소 가수분해 과정에서 과일 세포벽의 중교질과 펙틴이 파괴되어 중성 당이나 산과 같은 가용성 물질로 전환됩니다.62.효소 처리 사과 주스의 pH 값은 대조군보다 유의하게 낮았으며(P < 0.05), 두 그룹 모두 저장 기간 동안 pH 값이 유의하게 증가했다(표 1). 이러한 결과는 Mark et al.의 연구 결과와 일치한다.63연구진은 열처리 후 저장 기간 동안 캐슈 열매 주스의 pH가 감소하는 것을 관찰했습니다. 효소 처리 후 펙틴 분해 및 갈락투론산 생성이 저장 중 pH 증가의 원인일 수 있습니다. 효소 처리된 시료의 pH는 저장 기간 내내 4.05~4.31 사이를 유지한 반면, 처리되지 않은 사과 주스의 pH는 4.12~4.33 사이였습니다.
처리하지 않은 시료와 라카아제로 처리한 시료 모두 총산도(TA)는 저장 기간이 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였다(표 1). 산도 감소는 유기산이 탄수화물로 전환되거나 효소 반응에 의한 것이며, 주스 저장 중 산화 작용 때문으로 추정된다.64대조군 사과 주스와 효소 처리 샘플의 총 산도는 다른 주스(딸기 주스 0.9%, 자두 주스 2.2%, 금귤 주스 1.0%, 살구 주스 2.4%, 오렌지 주스 0.8%)보다 낮았지만, 다른 주스(예: 배 주스 0.3%)와는 유사했습니다.62가공하지 않은 갓 짜낸 사과 주스의 이러한 차이는 재배 조건, 유전적 요인, 숙성 정도 및 가공 방법과 같은 다양한 요인에 기인할 수 있습니다.65대조군과 라카아제 처리 사과 주스의 총 산도 감소는 Singh et al.이 제시한 결과와 일치합니다.66진누오 사과 주스의 총 산도가 74일 저장 후 감소하는 것과 관련하여. 한편, 오슈미안스키와 보이딜로는67전통적인 정제 방법의 효과를 연구했을 때 사과 주스의 산도에 유의미한 변화는 발견되지 않았습니다.
표 1에 제시된 결과는 라카아제로 처리한 사과 주스의 총 가용성 고형물(TSS) 값이 처리하지 않은 시료보다 높다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 기존 연구 결과와 일치합니다.. 68또한, 표 1은 대조군 사과 주스 그룹의 TSS 값이 초기 시점에서 9.58이었고 저장 기간이 끝날 무렵 11.05에 도달했음을 보여줍니다. 이 값들은 Hamid et al.이 보고한 신선한 사과 주스의 TSS 값보다 낮습니다.. 69(각각 11.2 및 11.80). 라카아제로 처리한 사과 주스 샘플의 총 가용성 고형물(TSS) 값은 11.23에서 시작하여 4°C에서 2주간 보관 후 12.93까지 유의하게 증가했습니다(표 1). 저장 중 TSS의 유사한 증가는 감귤류 과일인 레몬과 스위트 오렌지에서도 관찰되었습니다. 저장 중 총 가용성 고형물(TSS)의 증가는 다당류(전분)의 단당류(당)로의 가수분해, 주스 탈수로 인한 농도 증가, 주스 내 펙틴의 가용성 고형물로의 분해 때문일 수 있습니다. 총 가용성 고형물(TSS)의 증가는 가용성 당의 증가 때문일 가능성이 높은데, 이는 펙틴이나 셀룰로오스가 각각 펙틴이나 셀룰라아제에 의해 가용성 당으로 전환되거나, 전분이 당으로 가수분해됨으로써 생성될 수 있다고 Hamed et al.은 보고했습니다.69.라카아제 효소가 사과 주스의 특성에 미치는 영향은 육안으로 확인할 수 있는데, 라카아제로 처리한 사과 주스는 처리하지 않은 주스에 비해 유동성이 좋고 점도가 낮습니다. 이러한 관찰 결과는 표 1에 나타나 있습니다. 효소 처리 시료의 점도는 1.87 cP인 반면, 대조군 시료의 점도는 2.95 cP였습니다. 이러한 점도의 현저한 감소는 펙틴 유사 물질의 수분 보유 능력 증가와 응집성 네트워크 구조 형성에 기인하는 것으로 추정됩니다.
본 연구에서는 분광광도계를 이용하여 420nm에서의 흡광도를 측정함으로써 라카아제가 사과주스의 갈변지수(BI)에 미치는 영향을 조사하였다. 결과는 표 1에 제시되어 있다. 저장 기간 동안 라카아제 처리군과 미처리군 모두에서 사과주스의 BI가 점진적으로 증가하는 경향을 보였다. BI는 갈변 정도를 반영하는 지표로서, 사과주스의 갈변 정도를 평가하는 데 활용될 수 있다.중요한효소적 및 비효소적 갈변 반응의 지표. 흡광도는 저장 기간 동안 유의하게 증가했습니다(P < 0.05). 저장 종료 시점에,에이420대조군과 효소 처리군의 사과 주스 시료의 갈변도는 각각 약 217%와 121% 증가했습니다(표 1). 이 결과는 효소 처리가 갈변도를 약 56% 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여줍니다. Bezerra 등의 연구 결과와도 일치합니다.[19]는 우리의 결과와 일치합니다. 그들은 라카아제-글루타르알데히드-코코넛 섬유를 사용하여 사과 주스를 정제하고 원래 색상을 61% 감소시켰습니다.
과일 주스에 함유된 폴리페놀은 인체에 긍정적인 영양학적 및 치료적 효과를 주지만, 단백질과 반응하여 주스를 탁하게 만들거나 침전물을 생성시켜 제품의 맛과 향을 변화시키고 유통기한을 단축시킬 수도 있습니다.71본 연구의 목적은 느타리버섯(Pleurotus ostreatus NRC 620) 유래 라카아제를 이용하여 사과 주스의 페놀 화합물 함량을 안전하게 감소시키는 것이었다. 표 1에 제시된 결과는 라카아제로 처리한 사과 주스의 총 페놀 화합물 함량이 4°C에서 저장하기 전에 유의미하게 감소했음을 보여준다. 또한, 연구 대상 두 시료 모두 저장 중에도 총 페놀 화합물 함량이 감소했다(표 1). Sandri 등의 연구 결과와 비교해 볼 때,72효소 처리된 사과 주스가 항산화 활성과 페놀 화합물 함량을 유지할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 Lettera 등의 연구 결과는 다음과 같습니다.73곰팡이 라카아제로 오렌지 주스를 처리하면 페놀 화합물 함량을 최대 45%까지 줄일 수 있음을 보여줍니다.
페놀 화합물은 자유 라디칼 제거, 단일항 산소 환원 및 소멸, 수소 원자 전달, 자유 라디칼에 전자 제공과 같은 특성을 가지는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 특성으로 인해 강력한 항산화제로 작용합니다.74따라서 본 연구에서는 DPPH 및 FRAP 분석법을 이용하여 냉장 보관된 사과 주스의 항산화 활성에 대한 라카아제의 효과를 14일 동안 평가하였다(표 2). 두 분석법 모두 저장 기간 동안 항산화 활성이 증가하는 것을 보여주었는데, 이는 유리 페놀 화합물의 증가 또는 마이야르 반응 생성물(MRP)의 형성에 기인할 수 있으며, 마이야르 반응 생성물이 항산화 활성 증가의 주요 원인일 가능성이 높다.75비효소적 갈변 반응(아스코르브산 분해, 마이야르 반응, 산 촉매에 의한 당 분해 등)은 갈색 색소(멜라노이딘)를 생성합니다. 아스코르브산 분해 중간 생성물과 당 분해 생성물(예: 카르보닐 화합물)은 마이야르 반응을 통해 아미노산과 반응할 수 있습니다.76저장 중 과일과 채소의 갈변 현상은 광범위하게 연구되어 왔지만, 이러한 반응에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적입니다.77FRAP법과 비교했을 때, 라카아제 처리 사과 주스는 DPPH법으로 측정했을 때 항산화 활성이 유의하게 낮게 나타났습니다(표 2). 또한 모든 시료의 항산화 활성은 저장 기간이 증가함에 따라 유의하게 증가했습니다. 본 연구에서는 항산화 활성 측정에 두 가지 다른 방법을 사용했는데, 이는 두 방법의 원리가 다르기 때문입니다. DPPH법은 자유 라디칼을 중화하는 능력을 측정하는 반면, FRAP법은 철 이온을 환원하는 능력을 측정합니다. 따라서 연구 대상 시료의 항산화 활성을 보다 정확하게 이해하기 위해서는 여러 가지 항산화 활성 측정 방법을 함께 사용하는 것이 좋습니다.78
본 연구의 주요 결과 중 하나는 느타리버섯(Pleurotus ostreatus) 라카제 NRC 620이 70°C 및 pH 3.0에서 최적 활성을 나타낸다는 것입니다. 주스 정제에 일반적으로 사용되는 다른 곰팡이 유래 라카제인 어루러기(Trametes versicolor) 및 영지버섯(Ganoderma lucidum) 라카제와 비교했을 때, 느타리버섯 라카제 NRC 620은 더 높은 열 안정성과 더 낮은 산성 pH에서 최적 활성을 보입니다. 어루러기 및 영지버섯 라카제는 일반적으로 50~60°C 및 pH 3.5~5.0 범위에서 최적 활성을 나타냅니다. 이러한 차이는 특히 낮은 pH에서의 안정성이 중요한 산성 주스의 정제 효율 향상에 기여할 수 있습니다. 느타리버섯 라카제 NRC 620의 독특한 특성은 이러한 특성에 기인합니다. 다른 연구된 진균 라카아제와 비교했을 때, *Pleurotus ostreatus* NRC 620은 더욱 까다로운 조건에서도 효과적으로 작용하는 능력을 보여줍니다. 더 높은 최적 활성 온도는 더 빠른 반응 속도 및 미생물 오염 감소와 같은 산업 응용 분야에서 잠재적인 이점을 시사합니다. 또한, 많은 주스의 산성 특성에 적합한 낮은 pH는 주스 정제 공정에 유용할 수 있습니다. 이러한 결과는 대규모 응용을 위한 추가 연구를 정당화하며, *Pleurotus ostreatus* NRC 620을 기존의 진균 라카아제 공급원의 실행 가능한 대안으로 만듭니다. 이전 연구와 비교하여, 본 연구에서는 최적 온도가 60°C이고 최적 pH가 3.0임을 확인했습니다. 60°C에서 80분 동안 반응시킨 후, *Ganoderma lucidum* 라카아제는 다음과 같은 활성을 유지했습니다.46활동의 79%를 차지합니다. 쿠르니아와티와 니셀에 따르면80영지버섯(Ganoderma lucidum) 효소는 25°C 및 pH 5.0~8.0 범위에서 우수한 안정성을 보이며, pH 6.0 및 10~30°C 범위에서는 안정성을 나타냅니다. 본 연구에서는 느타리버섯(Pleurotus ostreatus) 효소의 최적 pH와 온도는 각각 3.0과 70°C임을 확인했습니다. 40°C와 50°C에서 2시간 배양 후, 효소 활성은 각각 68.33%와 59.61%를 유지했습니다. 또한, 느타리버섯 NRC 620 라카아제는 50°C에서 80°C에 이르는 넓은 온도 범위에서 높은 활성을 보였으며, 70°C에서 최대 활성을 나타냈고, 거의 최대 활성(69%~98%)에 근접했습니다.
결론적으로, 정적 조건에서 얻은 느타리버섯 라카아제 NRC620은 다양한 pH 및 온도 조건에서 최적의 활성과 안정성을 보였으며, 다른 효소 공급원에 비해 우수한 안정성을 나타냈다. 10 mM MgSO₄와 CuSO₄를 첨가했을 때 효소 활성은 각각 약 21%와 35% 증가했다. 이 효소를 사과 주스에 첨가했을 때, pH와 점도가 감소했으며, 페놀 함량은 저장 기간 동안 약간만 감소했다.
이번 연구 결과는 특히 음료 정제 분야에서 라카아제의 잠재력을 확인시켜 줍니다. 라카아제는 페놀 화합물을 특이적으로 분해하여 탁도를 낮추고 투명도를 향상시킬 뿐만 아니라, 온화한 조건에서도 과일 주스의 품질을 유지합니다. 젤라틴, 벤토나이트, 실리카겔과 같은 기존의 정제제와 달리, 라카아제는 폐기물을 발생시키지 않고 음료의 향을 제거하지 않아 더욱 친환경적이고 지속 가능한 선택입니다. 또한, 다른 효소 및 여과 방법과 비교했을 때, 라카아제는 제품 품질 저하 없이 효과적이고 비용 효율적인 해결책을 제공합니다.
Kyomuhimbo, HD 및 Brink, HG. 구리 함유 라카아제의 응용 및 고정화 전략; 리뷰. Heliyon 9, e13156 (2023).
게시 시간: 2025년 12월 15일